Bereich A: In-situ-Ionenquellen und -Detektionsmethoden

Projekt A1 (Zoltan Takats): ‚REIMS und JeDI: Neue Ionenquellen für die in-situ-Analytik'

Auf der Basis von schneller thermischer Verdampfung und Mikrofokus-Wasserstrahltechnologie werden zwei neuartige Ionisationsmethoden entwickelt, die ein hohes Potenzial für die direkte in-situ-Analytik besitzen.

Die Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry (REIMS) wurde von uns vorgestellt als Methode der schnellen Tiefenanalyse von z.B. biologischem Gewebe oder anderem wasserhaltigem Material. Die erzeugten molekularen Ionen sind weitgehend intakte Bestandteile des untersuchten Gewebes. Die spektralen Eigenschaften sind unabhängig von der gewählten Methode der Erhitzung. Die bislang untersuchten Verfahren sind Kontaktheizung, Widerstandsheizung mit DC und AC Strömen, Mikrowellenerhitzung und Laser-Erhitzung.

Nach bisherigen Erkenntnissen werden die Ionenerzeugungsrate und die unerwünschte thermische Degradation im Wesentlichen von der Wärmeverteilung in der Probe und der Heizrate beeinflusst. Wird die Wärme über eine Oberflächenerhitzung zugeführt (Kontaktheizung und UV/vis-Laser-Erhitzung), so wird eine starke thermische Degradation biologischer Proben in Form von Verkohlung und Karbonisierung beobachtet. Im Falle von Widerstandsheizung, Mikrowellenerhitzung und IR-Laser-Erhitzung, die eine Wärmefreisetzung im Volumen der Probe erzeugen, kann dagegen die thermische Degradation fast vollständig vermieden werden, wenn Heizleistung und -dauer optimiert werden. Dieses Projekt konzentriert sich vor allem auf die Entwicklung einer miniaturisierten Mikrowellenerhitzung zur Ionenerzeugung.

Als Alternative zur REIMS-Ionenquelle wird die Jet Desorption Ionization (JeDI) als Ionisierungsmethode eingesetzt und dazu eine in-situ Ionenquelle entwickelt. JeDI basiert auf der Wechselwirkung eines Hochgeschwindigkeits-Mikrowasserstrahls mit der zu analysierenden Oberfläche. Die JeDI-Methode ist von der bekannten Wasserstrahl-Schneidetechnik abgeleitet. Das durch den Flüssigkeitsstrahl erzeugte Aerosol wird durch den hohen elektrischen Feldgradienten, der zwischen Probe und Massenspektrometer angelegt wird, teilweise ionisiert. Das elektrische Potential kann wahlweise an die Flüssigkeitsstrahl-Düse, an die Probenoberfläche oder an die Einlassflächen des Massenspektrometers angelegt werden.

Im Vergleich zu REIMS ist JeDI eine „kalte" Ionisierungsmethode, die keine merkliche thermische Degradation der Probe verursacht. Allerdings verwendet JeDI nicht vernachlässigbare Mengen (ca. 1-2 mL/min) an Flüssigkeit unter hohem Druck, was die Praktikabilität unter Feldbedingungen möglicherweise einschränkt. Die analytischen Eigenschaften der beiden Methoden sind ebenfalls sehr unterschiedlich. Während REIMS sich besonders für den Nachweis niedermolekularer Stoffe mit hoher Gasphasenbasizität eignet (bzw. Gasphasenazidität für den Nachweis negativer Ionen), zeigt JeDI keine ausgeprägte Massenabhängigkeit und kann somit auch für den Nachweis von z.B. Peptiden oder Proteinen eingesetzt werden.

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Projekt A2 (Andreas Vilcinskas/Rolf-Alexander. Düring): ‚Elektroantennografie'

Die Antennen von Insekten gehören zu den empfindlichsten und kleinsten Sinnesorganen zur Wahrnehmung von Düften, welche die natürliche Evolution hervorgebracht hat. Mit Hilfe dieser Biosensoren können sie geringste Konzentrationen bestimmter Duftmolekülle registrieren und so über große Distanzen zielgerichtet z.B. Nahrung oder Geschlechtspartner finden. Bekannt sind Schmetterlingsarten, bei denen die Weibchen mit Hilfe von artspezifischen Duftmolekülen (Pheromonen) Männchen über Entfernungen von mehreren Kilometern anlocken können. Bereits einzelne Moleküle, die von Rezeptoren auf der Insektenantenne erkannt werden, führen zu elektrischen Impulsen, die über Nerven zur Verarbeitung an das Gehirn geleitet werden. Diese Nervenimpulse lassen sich in der Insektenantenne mit feinen Elektroden ableiten und können mit Hilfe eines Verstärkersystems detektiert und analysiert werden. Diese als Elektroantennografie bezeichnete Technik wurde bisher eingesetzt, um herauszufinden, welche Duftmoleküle bestimmte Insektenarten riechen können. Da abgetrennte Insektenantennen über mehrere Tage hinweg funktionsfähig bleiben, sollen diese innerhalb des Projektes auf einer tragbaren Elektroantennografie-Apparatur mit einem miniaturisierten Massenspektrometer für die in-situ- Analytik kombiniert werden. Durch die Verknüpfung soll zum einen die Identifizierung und Charakterisierung der detektierten Stoffe ermöglicht werden, zum anderen sollen die über die Antennografie zugänglichen Informationen leicht flüchtiger Bestandteile einer in-situ-Probe erweitert und korreliert werden mit Informationen, die mithilfe der in-situ-Desorptionsverfahren schwerer flüchtiger Stoffe (z.B. REIMS oder JeDI) zugänglich sind. Dadurch kann eine zeitliche, räumliche und strukturelle Korrelation innerhalb komplexer in-situ-Proben erreicht werden. Ziel des Projektes ist die Entwicklung von extrem empfindlichen Biosensorsystemen, die sich u.a. zur Suche nach Drogen oder Sprengstoffen, zum Auffinden von Leichen und zur Detektion von Giften und Schadstoffen in der Nahrung oder in der Umwelt eignen.

Ein weiteres Ziel des Projektes ist die Bereitstellung und Kalibrierung von geeigneten Insektenantennen für den Einsatz im GUKS-Bereich. Hierfür bieten sich Bienen an, die sich gezielt auf bestimmte Duftstoffe (z.B. Drogen) prägen lassen, die einfach dem Futter beigemengt werden können. Es stehen somit Biosensoren zur Verfügung, deren Signalmuster sich eignet, vom neuronalen Netz des Bienengehirns (und damit auch von einem geeigneten künstlichen neuronalen Netz) in einem Lernprozess ausgewertet zu werden. Diese potenzielle Lernfähigkeit (Programmierbarkeit) der eingesetzten Biosensoren kann in idealer Weise die Zielsetzungen der in-situ-Analytik unterstützen. Auch viele nicht-prägbare Insektenarten sind darüber hinaus aufgrund ihrer Spezialisierung auf die Wahrnehmung analytisch relevanter Duftstoffe für den Einsatz in entsprechenden Anwendungsbereichen prädestiniert, z.B. könnten die Antennen des Totengräber-Käfers (Necrophorus), der über große Distanzen zielgerichtet Kadaver zur Fortpflanzung aufsucht, zur Suche nach Leichen in Katastrophengebieten verwendet werden.

Ein weiteres projektiertes Anwendungsgebiet der Elektroantennografie ergibt sich aus der Tatsache, dass viele Pflanzen ihr Duftbouquet ändern, wenn sie von Pathogenen oder Parasiten befallen werden, um auf diese Weise nützliche Insekten anzulocken, die auf solche Alarmdüfte reagieren. Deren Antennen sollen mit der zu entwickelnden Technologie genutzt werden, um neue Frühwarnsysteme im Pflanzenschutz zu etablieren, mit denen der Pestizideinsatz reduziert werden kann.

Für den Bereich der Umweltanalytik stellt die Anwendung der Elektroantennografie ein Novum dar; auch hier ist der empfindliche Nachweis flüchtiger Stoffe häufig erforderlich. In Verbindung mit der in-situ-Massenspektrometrie könnte man dem hohen Bedarf orientierender Untersuchungen in der Altlastenerkundung und -behandlung gerecht werden und etwa den hohen Aufwand invasiver Bodenuntersuchungen reduzieren bzw. ein wesentlich engmaschigeres flächendeckendes Screening-Netz zur Umweltaufklärung schaffen.

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Projekt A3 (Bernhard Spengler/Wolf-Dieter Lehmann): ‚Laser- und Elektrospray-basierte Methoden der in-situ-Ionenerzeugung'

Elektrospray-Ionisation (ESI) und Matrix-assistierte Laserdesorptions-Ionisation (MALDI) haben sich als universelle und herausragende Methoden der Ionenerzeugung erwiesen. Ihr Einsatz in mobilen in-situ-Massenspektrometern erfordert eine Adaption an die besonderen Bedingungen, die durch die räumliche Trennung von Analyt-Mobilisierung, Transfer, (Nach)-Ionisation und Massenanalyse entstehen. Durch die räumliche Trennung ergeben sich zudem neue Möglichkeiten, die den Informationsgehalt der in-situ-Analyse erheblich steigern können. Im Rahmen des Projektes werden die Möglichkeiten der Elektrospray-basierten Nachionisation von transportierten Neutralteilchen eingesetzt, um die in-situ-Analytik zu optimieren. Dazu werden desorbierte und transportierte Analyt-Moleküle oder -Partikel in einen ESI-Spray eingekoppelt.

Als Massenanalysatoren bei vor-Ort-Analysen werden in der Regel Ionenfallen oder TOF-Analysatoren
eingesetzt (siehe Projekt C1), also Systeme mit niedriger oder mittlerer Massenauflösung. Eine hierzu alternative und attraktive Möglichkeit der mobilen Hochleistungsmassenspektrometrie mit in-situ-Strukturaufklärung (Projekte C2 und C3) wird im Rahmen des Schwerpunktes exploriert. Für die greifbaren Wege der vor-Ort-Analyse wird nach Möglichkeiten zur Erhöhung der Spezifität der analytischen Aussage gesucht, um die begrenzte Spezifität der massenspektrometrischen Daten zu kompensieren. Schneller, reversibler Protonen/Deuteronen-Austausch (H/D-Austausch) in der Gasphase wird als eine solche Zusatzmethode instrumentell entwickelt und evaluiert. H/DAustausch liefert eine strukturelle Aussage über die im Analyt-Molekül vorhandenen aziden, also im Säure-Base-Gleichgewicht austauschbaren, Protonen. Die Kenntnis der Zahl austauschbarer Protonen erhöht die Spezifität von analytischen Zuordnungen erheblich. Diese Zahl ist auch mit Systemen niedriger und mittlerer Auflösung bestimmbar. MS/MS Spektren von Analyten mit H/D-ausgetauschten Wasserstoff-Positionen erhöhen diese Spezifität weiter, weil nicht nur das Moleküilion, sondern auch Substrukturen hinsichtlich der Zahl der ausgetauschten H-Positionen charakterisiert werden.

Neben der Gesamtzahl der austauschbaren Protonen liefert auch die Austauschgeschwindigkeit wertvolle strukturelle Informationen. Die Kinetik des Austausches hängt dabei von der Azidität der jeweiligen Wasserstoff-Positionen, sowie bei größeren Systemen (Proteinen) auch von der räumlichen Zugänglichkeit und Umgebungs-Hydrophilie der individuellen Positionen ab. Der H/D-Gasphasenaustausch im Ionisierungs-Raum einer ESI oder Sekundär-ESI-Quelle wird technisch so entwickelt, dass er schnell an- und abgeschaltet werden kann (Sekunden-Bereich). Im MS- und MS/MS-Modus werdem jeweils Spektren mit und ohne H/D-Austausch registriert und differentiell ausgewertet. Die Auswertung beinhaltet dann die Bestimmung der durch den H/D-Austausch veursachten Massenverschiebung. Grundlage für dieses Konzept ist die Beobachtung, dass bei ESI ein momentan wirksamer Austausch von aziden Protonen der Analyten erfolgt, wenn die Ionenbildung in einer ESI-Quelle mit D2O-angereicherter Atmosphäre erfolgt. Die erzielte zusätzliche analytische Information lässt sich in die bestehenden Auswertungsstrategien der zu entwickelnden in-situ-Massenspektrometrie integrieren. Die H/D-Austausch-Spektrometrie wird die Aussagekraft der Analytik mit Ionenfallen und Flugzeit-MS-Systemen erheblich erhöhen. Darüber hinaus wird das Austauschsystem auch für die zu entwickelnde Hochauflösungs-MR-TOF-MS eingesetzt werden. Es konnte von uns bereits gezeigt werden, dass die Information über die Zahl austauschbarer Protonen auch im Verfahren der kompositionsbasierten Sequenzierung von Proteinen aus hochgenauen Massendaten zu erheblichen Spezifitätsgewinnen und schnelleren und sichereren Strukturaufklärungen führt.

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