Bereich C: Analyse und Informationsgewinnung

Projekt C1 (Klaus-Peter Hinz/Zoltan Takats): ‚Miniaturisierte feldtaugliche Massenanalysatoren'

Die Suche nach einem geeigneten Massenanalysator für die in-situ-Analytik wird vor allem durch die folgenden Bedingungen bestimmt:

  • geometrische Abmessungen und Gewicht,
  • Möglichkeit des mobilen Einsatzes,
  • Anforderungen an äußere technische Versorgung,
  • Unempfindlichkeit gegenüber mechanischen, elektrischen und magnetischen Einflüssen,
  • analytischer Informationsgehalt der Daten,
  • Kosten-Nutzen-Verhältnis.

Mehrere Analysatortypen, wie z.B. Sektorfeldgeräte und Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer scheiden aufgrund dieser Bedingungen unmittelbar aus. Unter den etablierten massenspektrometrischen Analysatortechniken kommen danach nur Flugzeit-Analysatoren, Quadrupolfilter und Quadrupol-Ionenfallen für die mobile in-situ-Analytik in Betracht. Verzichtet man auf den Weg der noch nicht zu den Standardverfahren gehörenden kompositionsbasierten Datenauswertung aus hochauflösenden Analysatoren (Projekte C2 und C3), so ergibt sich aufgrund der fehlenden Vortrennung der komplexen in-situ-Proben die Notwendigkeit der mehrdimensionalen Massenspektrometrie zur internen Auftrennung und Identifizierung.

Damit verbleibt lediglich die Quadrupol-Ionenfallentechnologie als gangbarer Weg. Kosten-Nutzen-Relation, analytische Aussagekraft, Stabilität und Unempfindlichkeit sind bei diesem Analysatortyp ausgesprochen günstig. Zudem sind Quadrupol-Ionenfallen in äußerst kleinen Abmessungen vorgestellt worden, bis herunter in den Mikromaßstab. Ein Vorteil von Flugzeit-Massenanalysatoren ist hingegen, dass Ionen beider Polaritäten aus demselben Primerereignis analysiert werden können. Somit ist zu erwarten, dass Ionen beider Polaritäten in einer in-situ-Analyse mithilfe z.B. der REIMS-Methode erzeugt, in einem Gasstrom transportiert und dann in einen bipolaren Flugzeitanalysator nach Polarität getrennt und analysiert werden können.

Miniaturisierte Quadrupol-Ionenfallen und bipolare Flugzeit-Massenanalysatoren stellen somit zwei herausragende Möglichkeiten für die mobile in-situ-Analytik dar, die in diesem Projekt adaptiert und nutzbar gemacht werden. Eine wichtige Eigenschaft der zylindrischen Ionenfallen ist die Kompatibilität mit relativ hohen Drücken im Analysator, was die Anforderungen an das mobile Vakuumsystem erheblich verringert. Eine kommerzielle Ionenfalle vom Typ ‚LCQ Deca' (Thermo Fisher Scientific GmbH) dient als Testaufbau für die instrumentelle Entwicklung in diesem Projekt. Da dieser Fallentyp ebenfalls eine zylindrische Geometrie nutzt, können sämtliche Geräte-Komponenten wie Ionenoptik, elektronische Steuerung und Datenakquisition unabhängig getestet und gegen eigen-entwickelte angepasste und miniaturisierte Komponenten ausgetauscht werden.

Zunächst wird ein Massenanalysator für in-situ-Analytik entwickelt, anschließend das Atmosphärendruck-Interface und eine neue Ionenoptik implementiert. Im Folgenden werden computergesteuerte Radiofrequenz-Wechsel- und Gleichspannungsquellen entwickelt, die in eine neue LabView-basierte Kontrollsoftware zu integrieren sind. Schließlich sind ein miniaturisiertes Vakuumsystem und ein Gehäuse für das neue Gesamtsystem zu entwickeln. Das Vakuumsystem wird aus zweistufigen Membranpumpen und miniaturisierten Turbomolekularpumpen bestehen. Durch die Optimierung und Anpassung an die Parameter und Anforderungen der neuen in-situ-Ionenquellen (Projekt A1 bis A3) wird das miniaturisierte Quadrupol-Ionenfallen-System gegenüber bisherigen miniaturisierten Systemen erhebliche Vorteile aufweisen.

Im Bereich der bipolaren Flugzeit-Massenspektrometrie ist eine Anpassung und Erweiterung eines für die Analytik atmosphärischer Aerosole entwickelten Systems, an die neuartigen Ionen- und Partikeltransfersysteme (Projekt B1) vorgesehen, die dann eine direkte bipolare Einzelpartikelanalyse in-situ-ablatierter Stoffe ermöglicht. Dazu wird das Einlasssystem des bipolaren Flugzeit-Massenspektrometers mit einem aerodynamischen Linsensystem ausgerüstet um eine eine hohe Transmission für Partikel zu erreichen. Das Partikel-Luft-Gemisch tritt durch eine Eintrittsöffnung in die aerodynamische Linse ein und durchströmt mehrere Lochblenden in geeignetem Abstand. Durch Wahl unterschiedlicher Eintrittsöffnungen und entsprechend angepasstem Druckgefälle ist es möglich verschiedene Partikelgrößenbereiche mit hoher Effizienz in das Massenspektrometer einzuleiten. Die Kontrolle und die korrekte Einstellung des Druckgefälles durch geeignete Sensoren bzw. Ventile sind von entscheidender Bedeutung für eine hohe Transmission der Partikel. Diese kann im Vergleich zu einem herkömmlichen System mit Düse, Skimmer und Blende bis zu einem Faktor 100 verbessert werden.

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Projekt C2 (Wolfgang Plaß/Christoph Scheidenberger): ‚Mobile hochauflösende Multireflektor-Flugzeitmassenspektrometrie'

Massenspektrometrische Verfahren in der Bioanalytik wie die de-novo Peptidsequenzierung (Projekt C3) setzen eine sehr hohe Massenauflösung und Massengenauigkeit des Massenspektrometers voraus, wie sie zur Zeit noch nicht von mobilen Geräten erreicht werden.

In diesem Vorhaben wird erstmals ein solches hochauflösendes und hochgenaues mobiles Massenspektrometer entwickelt. Bei Multireflexions-Flugzeitmassenspektrometern (multiple-reflection time-of-flight mass spectrometers, MR-TOF-MS) wird die Flugstrecke von den zu analysierenden Ionen vielfach durchlaufen, so dass sowohl ein sehr kompakter Aufbau als auch im Vergleich zu einfach reflektierenden Flugzeitmassenspektrometern ein drastisch gesteigertes Massenauflösungsvermögen möglich ist.

Bisher wurde ein Massenauflösungsvermögen von 100.000 in einem Analysator mit einer Gesamtlänge von nur 40 cm erreicht. Ionen werden aus einer atmosphärischen Ionenquelle durch ein differenziell gepumptes Transportsystem in das Massenspektrometer eingeführt, in einem Radiofrequenz-Quadrupol (RFQ) gekühlt, in einer Radiofrequenzfalle akkumuliert und geplust in den Flugzeitanalysator injiziert. Im Analysator laufen die Ionen vielfach zwischen zwei gitterfreien elektrostatischen Spiegeln hin- und her, bis sie auf einen Detektor ausgeschossen werden. Zum Ein- und Ausschuss werden dazu die Spannungen an den Spiegeln heruntergepulst. Die Zykluszeit des MR-TOF-MS beträgt nur wenige Millisekunden, so dass auch die Untersuchung von zeitabhängigen Prozessen oder die Kopplung mit Chromatographieverfahren oder Ionenmobilitätsspektrometern möglich ist. Da der Einschuss in den Flugzeitanalysator aus einer RF-Falle erfolgt und nicht direkt aus einer spezialisierten Ionenquelle, ist die Kopplung mit nahezu jeder Art von Ionenquelle möglich. Dadurch wird ein weiter Anwendungsbereich des MR-TOF-MS ermöglicht. Durch die Kopplung eines RF-Massenfilters und einer Stosszelle zwischen Kühler-RFQ und Injektionsfalle könnte ein solches Gerät auch als Tandem-Massenspektrometer betrieben werden.

Aufgrund der Kompaktheit eines MR-TOF-MS bietet sich die Multireflexions-Flugzeitmassenspektrometrie als ideale Basis für die Entwicklungs eines mobilen Höchstleistungsmassenspektrometers an. Die Vakuumanforderungen sind wegen der kurzen Flugzeit um mehrere Größenordnungen geringer als die von vergleichbaren hochauflösenden Massenspektrometern (z.B. Orbitrap). Wie die meisten Flugzeitmassenspektrometer kann auch ein mobiles MR-TOF-MS hinsichtlich des maximalen Masse-zu-Ladungsverhältnisses praktisch unbeschränkt sein. Allerdings kommt es durch die gefaltete Flugstrecke zu überlappenden Massenspektren. Die Rekonstruktion von eindeutigen Breitband-Massenspektren stellt deshalb eine besondere Aufgabe bei der Entwicklung von MR-TOF-MS für bioanalytische Anwendungen dar. Für einen stabilen und anwenderfreundlichen Betrieb unter wechselnden Betriebsbedingungen, wie in der in-situ-Massenspektrometrie gegeben, ist zudem ein dediziertes, selbstoptimierendes Kontroll- und Datenaufnahmesystem erforderlich. Im Ergebnis des Projektes wird ein mobiles und mobil erprobtes MR-TOF-MS dauerhaft zur Verfügung stehen.

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Projekt C3 (Bernhard Spengler): ‚In-situ-massenspektrometrische Strukturaufklärung und Identifizierung'

Die Auswertung hochgenauer Massenwerte von Molekül- und Fragmentionen ermöglicht die schnelle und sichere Strukturaufklärung und Identifizierung unbekannter Stoffe. Dabei können neuartige Strategien eingesetzt werden, die auf der Bestimmung der Zusammensetzung von Vorläuferionen und Fragmentionen beruhen (zusammensetzungsbasierte Sequenzierung/Strukturaufklärung, composition-based sequencing, CBS).

Hochgenaue Massenbestimmungen erlauben die Aufstellung überschaubarer Listen von möglichen Elementar- bzw. Baustein-Zusammensetzungen unterschiedlicher Substanzklassen, jeweils für Vorläuferionen und jedes individuelle Fragmention. Solche Bausteine größerer Moleküle sind z.B. die natürlichen Aminosäuren in Peptiden oder Proteinen oder die Nukleotide in Nukleinsäuren. Für den Fall der de-novo-Peptidsequenzierung (Bestimmung der Aminosäuresequenz von unbekannten Peptiden) ist das CBS-Verfahren bereits etabliert und erfolgreich eingesetzt worden.

Anders als bei herkömmlichen Verfahren der de-novo-Sequenzierung sind beim CBS-Verfahren keine weiteren Substanzkenntnisse oder Datenbanken erforderlich, so dass eine Analyse unmittelbar und universell erfolgen kann. Die erforderlichen Massengenauigkeiten liegen im oberen ppb-Bereich und können von (stationären) FT-ICR-Massenspektrometern oder von zu entwickelnden, mobilen MR-TOFSystemen erreicht werden. Für andere Substanzklassen existieren bislang keine entsprechenden
CBS-Algorithmen. Diese werden im Rahmen des Projektes für eine Reihe relevanter Substanzklassen wie Mykotoxine und ihre Metaboliten entwickelt. Es wird dazu eine algorithmische Strategie entwickelt, um eine allgemeine Lösung der kompositionsbasierten Strukturaufklärung für organische Moleküle zu finden. Eine grundlegende Substanzklasse, für die die CBS-Methode weiterentwickelt werden soll ist die der zyklischen Peptide, die im Zusammenhang mit Mykotoxinen von besonderer Bedeutung sind. Zyklische Peptide lassen sich mit herkömmlichen de-novo-Sequenzierungsverfahren nur äußerst unbefriedigend aufklären, da ihnen strukturbedingt Molekülanfang und -ende fehlen und damit ein Ansatzpunkt für typische wahrscheinlichkeitsbasierte Verfahren der Fragmentierungsweg-Analyse.

Das CBS-Verfahren ist demgegenüber invariant bezüglich der Annahme bestimmter Fragmentierungsmechanismen und -wege und berücksichtigt stattdessen lediglich die möglichen Baustein-Zusammensetzungen beobachteter Fragmentionen. Der Anwendungsbereich der Zyklopeptid-Mykotoxine ist somit ein zentrales Zielgebiet der CBS-Entwicklungen dieses Projektes. Neben der kompositionsbasierten Strukturaufklärung ist insbesondere bei Molekülen im unteren Massenbereich auch ohne Fragmentionenanalyse eine aussagekräftige Substanzklassenanalyse möglich. Die massenbasierte Klassifizierung (MBC) ermöglicht zum Beispiel die unmittelbare Unterscheidung von phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden ohne Fragmentionenanalyse.

Die MBC-Methode wird im Rahmen des Projektes für die Substanzklassen der zyklischen Peptide, der verschiedenen weiteren Mykotoxine und der Explosivstoffe entwickelt. Es werden im Rahmen des Projektes Softwaresysteme entwickelt, die eine effiziente Umsetzung der komplexen Algorithmen beinhalten und eine anwendungsorientierte Nutzung in situ ermöglichen.

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