Bereich D: Methodenvalidierung und Anwendung

Projekt D1 (Michael Karas): ‚Validierung feldtauglicher Analyseverfahren'

Eine fundierte Charakterisierung und Validierung der neuen analytischen Methoden ist von zentraler Bedeutung für die Übertragbarkeit und den Technologietransfer in Richtung einer Kommerzialisierung und breiten Verfügbarmachung der neuen analytischen Strategien. Um den Prozess der Bewertung der Leistungsfähigkeiten möglichst objektiv und aussagekräftig zu gestalten, sollen die Methoden in einem anerkannten Referenzlabor durchgeführt werden, das nicht unmittelbar mit dem Standort der Entwicklergruppen verknüpft ist.

Als Entwickler der MALDI-Massenspektrometrie und international exzellent ausgewiesenes Labor für Grundlagenforschung im Bereich der Elektrospray- und laserbasierten Ionenbildung ist die Arbeitsgruppe Karas in idealer Weise geeignet, die Bewertung der entwickelten in-situ-Verfahren durchzuführen und dabei Erfahrungen aus den Anwendungsbereichen der Pharmazeutischen Chemie und anderen lebenswissenschaftlichen Umfeldern einzubringen.

Die neuen Mobilisierungs-, Transfer- und Analyseverfahren (Bereiche A, B und C) werden im Projekt D1 hinsichtlich ihrer physikochemischen und analytischen Eigenschaften charakterisiert und bewertet. Dazu wird neben einer absoluten Einschätzung der Methodeneigenschaften eine relative Bewertung durch einen direkten Vergleich mit etablierten Hochleistungsverfahren wie der matrix-assistierten Laserdesorption/Ionisation (MALDI) und der Elektrospray-Ionsiation (ESI) an state-of-the-art-Massenspektrometern durchgefu¨hrt. Als beispielhafte Analytsysteme und Basis der Validierung werden dafu¨r typische Substanzklassen herangezogen, die für den Zielbereich ‚Chemische Sicherheit' in Gesundheit, Umwelt, Klima und Terrorprävention von zentraler Relevanz sind.

Dazu gehören im Einzelnen:

  • Zyklische Peptide wie Cyclosporin als wichtige Vertreter der Mykotoxine, in ihrem typischen Auftreten als Lebensmittelgifte und als Innenraum-Aerosole,
  • Aflatoxine als weitere bedeutsame Gruppe der Mykotoxine, die neben ihrer Relevanz für die Lebensmittelsicherheit auch im Verdacht stehen wegen der einfachen Herstellung als potenzielle Kampfstoffe in Betracht gezogen zu werden,
  • Niedermolekulare organische Stoffe wie das für die Lebensmittelsicherheit bedeutsame Melamin,
  • Standardisierte Peptidgemische als Repräsentanten von enzymatisch abgebauten Proteinen.

Im Ergebnis werden die geprüften Methoden eingruppiert hinsichtlich ihrer Leistungs- und Konkurrenzfähigkeit, zugeordnet jeweils zu relevanten Aufgabenbereichen und Problemkreisen. Die resultierende dreidimensionale Leistungsmatrix (Methode - Problembereich/Substanzklasse - analytischer Leistungsparameter) dient als Basis für die Anwendung auf reale analytische Fragestellungen in Projekt D2. Um eine zielgerichtete und effizienteEntwicklungsstrategie sicherzustellen, arbeitet das Referenzlabor während des gesamten Projektzeitraumes als beratende und prüfende Expertenplattform aktiv an den Einzelprojekten mit. Es werden dazu zu allen strategischen Schritten der Methodenentwicklungen Bezüge zu etablierten instrumentellen Lösungen und validierten analytischen Methoden hergestellt und vermittelt.

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Projekt D2 (Andreas Römpp): ‚Identifizierung, Abwehr und Nutzung bioaktiver Naturstoffe'

Im Rahmen dieses Projektes werden die Ergebnisse der Projektbereiche A bis D zusammengeführt, um die Fortschritte des Schwerpunktes anhand realer Anwendungsfälle zu demonstrieren. Als Beispiel dienen dabei zum einen Mykotoxine in Nahrungsmitteln und zum anderen Peptide und Proteine, die als Biomarker für Krebserkrankungen dienen können.

Mykotoxine sind hochtoxische Verbindungen, die ein bedeutendes Risiko für den Verbraucher darstellen. Eine schnelle und zuverlässige Detektion z. B. bereits während der Ernte oder während der Weiterverarbeitung ist deshalb von entscheidender Bedeutung.

Biomarker ermöglichen die frühzeitige Diagnose von Erkrankungen und erlauben eine angepasste und dadurch effizientere Therapie.

Besonders in der Anfangszeit ist bei diesen Anwendungen noch eine breite Unterstützung bzw. Absicherung durch etablierte analytisch-chemische Methoden notwendig. Dazu wird die Kopplung von Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) verwendet. Die chromatographische Auftrennung, als Grundlage einer effizienten Analyse, wird durch den Einsatz einer nanoskaligen HPLC mit Flussraten im Nanoliterbereich erreicht. Zur anschließenden Detektion wird ein Hochleistungs-Hybridmassenspektrometer, bestehend aus einer linearen Ionenfalle und einem Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer, verwendet.

Diese Kombination erlaubt eine hochgenaue Bestimmung der Molekülmasse, bei gleichzeitiger hochempfindlicher Detektion der Fragmentionen. Diese Informationen sind für die strukturelle Aufklärung der Naturstoffe von entscheidender Bedeutung, da bestehende Algorithmen und Datenbanken oft nur auf Messungen mit geringer Auflösung aufbauen. Durch die systematische Einbeziehung einer hohen Massengenauigkeit (Projekt C2) kann die Spezifität der Messungen und damit die Zuverlässigkeit der Identifizierung wesentlich verbessert werden (inbesondere unter Einbeziehung der CBS/MBC-basierten Software aus Projekt C3). Dies ist besonders wichtig für eine schnelle und vor allem eindeutige Identifizierung durch die neu zu entwickelnden in-situ Methoden. Abgesehen von der höheren Empfindlichkeit durch vorherige Probenbehandlung ist auch die höhere Fragmentierungseffizient der mehrfach geladenen Ionen aus der Elektrospray-Ionisation hilfreich bei der Identifizierung der Naturstoffe.

Des Weiteren werden innerhalb des Projektes Softwaretools zur schnellen und intelligenten Verknüpfung der in-situ- mit offline-Referenzdaten entwickelt. In der Anfangsphase werden die Anwendungsbeispiele mit Hilfe der Referenzmethoden untersucht. Dadurch wird eine fundierte Basis zur späteren Einordnung und Integration der in-situ-Ergebnisse geschaffen. Im Bereich der Mykotoxine liegt der Schwerpunkt auf Aflatoxinen und Cyclopeptiden. Bei den Biomarkern sind vor allem Lipide, Peptide und Proteine von Interesse.

Mit Verfügbarkeit der neuen in-situ-Methoden (A1 bis A3), werden diese in die Messungen einbezogen. Im weiteren Verlauf des Projektes werden reale Proben in der jeweiligen Anwendungsumgebung analysiert.

Es ist wichtig zu betonen, dass beide Ansätze komplementäre Informationen liefern. Die off-line-Methoden liefern detailierte Informationen über die Zusammensetzung der Probe mit hoher Nachweisempfindlichkeit und ermöglichen die Identifizierung unbekannter Verbindungen, erfordern aber einen wesentlich höheren Zeitaufwand. Die in-situ-Methoden liefern andererseits Ergebnisse in Echtzeit mit hoher Zeitauflösung, möglicherweise begrenzt auf eine limitierte Anzahl von Analyten. Die Kombination dieser beiden Verfahren führt zu einer Informationsfülle, die mit herkömmlichen Methoden nicht erreichbar ist.